Kurzbeschreibung
Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC, engl. „isothermal titration calorimetry“) ist eine biophysikalische Technik, die zur Bestimmung von Bindungsstöchiometrie, -affinität und thermodynamischen Parametern biochemischer Bindungsprozesse eingesetzt wird. Es ermöglicht eine direkte, markierungsfreie Messung aller Bindungsparameter in einem einzigen Experiment. Charakterisiert werden Interaktionen zwischen kleinen Molekülen, Proteinen, Antikörpern, Nukleinsäuren, Lipiden usw. Das PEAQ-ITC Automated System ist zusätzlich vollständig automatisiert und bietet daher die Möglichkeit eines unbeaufsichtigten Betriebs für erhöhte Produktivität.
Ansprechperson
Irene Schaffner
Research Services
Bitte um Kontaktaufnahme per email unter bmca@boku.ac.at
Methoden & Expertise zur Forschungsinfrastruktur
Ein isothermes Titrationsmikrokalorimeter besteht aus zwei identischen Zellen (Probenzelle und Referenzzelle). Die Referenzzelle enthält (meist) Wasser, die Probenzelle enthält einen der Bindungspartner (oft ein Makromolekül). Die beiden Zellen werden auf exakt gleicher Temperatur gehalten. Während des Experiments werden genau bekannte Mengen des Liganden (üblicherweise in Aliquoten von 0,5-3 µL) zugegeben, was entweder eine Aufnahme (endotherme Reaktion) oder Abgabe (exotherme Reaktion) von Wärme zur Folge hat. ITC überwacht diese Wärmemengenänderungen, indem sie den Leistungsunterschied der Zellenheizungen misst, der benötigt wird, um den Temperaturunterschied zwischen der Referenz- und der Probenzelle auszugleichen. Die Messergebnisse werden als die zur Aufrechterhaltung gleicher Temperaturen benötigte Leistung in μcal/s gegen die Zeit in s aufgetragen. Jeder Zacken („Spike“) in diesem Diagramm entspricht einer Ligandeninjektion. Die Fläche unter jedem Peak entspricht der Wärmemenge, die bei dieser Injektion aufgenommen oder abgegeben wurde. Die einzelnen Peakflächen werden anschließend integriert und gegen das molare Verhältnis zwischen Ligand und Protein aufgetragen. Die resultierende Isotherme kann an ein Bindungsmodell angepasst werden, um die Affinität (KD), die Stöchiometrie (n) und die Enthalpie der Wechselwirkung (ΔH) abzuleiten. Ein einziges ITC-Experiment liefert somit eine Fülle an Informationen über die Bindungsreaktion und hilft damit, die Art der Wechselwirkung und die thermodynamischen Ursachen zu verstehen.
Das System kann mit bis zu 384 Proben beladen werden von denen bis zu 42 in 42 h abgearbeitet werden können. Biomoleküle werden in ihrem nativen Zustand analysiert. Dissoziationskonstanten können bis in den pikomolaren Bereich durch direkte oder kompetitive Analyse bestimmt werden.
Anwendungsgebiete umfassen unter anderem die Bestimmung der Bindungsaffinität, die Auswahl geeigneter Kandidaten für weitere Optimierung, die Charakterisierung des Bindungsmechanismus, die Bestimmung der Bindungsspezifität und Stöchiometrie oder die Messung von Enzymkinetik.